📋 实验流程
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细胞刺激与样品收集
30 min处理细胞并按时程刺激，终止反应后收集裂解液
💡 技巧 设未刺激对照其时程梯度
⚠️ 注意 及时灭活激酶/磷酸酶防信号变化
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2
蛋白定量与标准化
1 h定量蛋白浓度并调整等量上样，保证信号可比
💡 技巧 上样量一致保定量可靠
⚠️ 注意 定量误差会影响通路比较
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3
免疫印迹检测磷酸化
1 天SDS-PAGE分离后转膜，用磷酸化特异性抗体及总蛋白抗体检测
💡 技巧 同对磷酸化/总蛋白抗体比较
⚠️ 注意 内参和总蛋白标准化
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4
抑制剂验证与整合
1 天用通路抑制剂处理确认信号的因果性，整合数据绘制通路图
💡 技巧 多激酶抑制剂交叉验证
⚠️ 注意 抑制剂选择性需确认
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 裂解不及时致磷酸化丢失
- ② 抗体特异性差致假带
- ③ 上样不均影响定量比较
- ④ 抑制剂量过高致非特异效应
- ⑤ 缺内参或总蛋白标准化
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+如何选择磷酸化抗体？
选经验证过、特异识别特定磷酸化位点的抗体，并配总蛋白抗体对照。
+为什么需时间梯度？
磷酸化信号是动态的，时间梯度可显示激活动力学与峰期。
+抑制剂如何验证通路？
抑制上游激酶后若下游磷酸化下降，则证实通路级联的因果依赖。