📋 实验流程
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RNA 提取与反转录
1 h提取总 RNA，测定浓度纯度（A260/A280），反转录成 cDNA。
💡 技巧 RNA 极易降解，全程无 RNA 酶操作（DEPC 水、无 RNase 耗材）。
⚠️ 注意 A260/A280 应在 1.8–2.0，太低说明有蛋白污染。
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2
引物设计
30 min设计跨外显子引物（避免基因组 DNA 污染），产物 80–150 bp。
💡 技巧 引物 Tm 约 60°C，GC 含量 40–60%，产物跨外显子接头。
⚠️ 注意 先做普通 PCR 验证引物特异性（单一条带）。
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3
配制反应体系
20 min冰上配制：SYBR Green Mix、引物、cDNA 模板、水，每个样做 3 个复孔。
💡 技巧 配 Master Mix（含 SYBR 与引物）再分装，减少复孔误差。
⚠️ 注意 SYBR Green 避光操作，避免反复冻融。
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4
上机运行
1.5 h设置程序：95°C 变性 → 退火延伸 40 循环，采集荧光。
💡 技巧 务必做熔解曲线，SYBR 法靠它判断非特异扩增。
⚠️ 注意 设置 NTC（无模板对照）检测污染。
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5
数据分析（ΔΔCt 法）
40 min用内参基因归一，计算 ΔΔCt 得到相对表达量。
💡 技巧 内参选表达稳定的管家基因（GAPDH/β-actin），先验证其稳定性。
⚠️ 注意 扩增效率应在 90–110%，偏差大需重新优化。
⚠️ 新手常犯的 4 个错误（避坑指南）
- ① RNA 降解：提取/操作不无 RNase，导致 Ct 值偏高或假阴性。
- ② 引物二聚体：熔解曲线出现 70–80°C 的杂峰，需重新设计引物。
- ③ 忘了复孔/NTC：无复孔无法算误差，无 NTC 无法判断污染。
- ④ 内参选择不当：内参本身表达变化，导致结果失真。
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+熔解曲线有多个峰怎么办？
说明有非特异扩增或引物二聚体。重新设计引物、提高退火温度、降低引物浓度。
+Ct 值很高（>35）怎么办？
模板量太少或降解。增加模板、检查 RNA 质量、必要时重新提取。
+复孔 Ct 值差异大怎么办？
加样误差或气泡。用 Master Mix 减少误差、离心除气泡、检查移液器。