📋 实验流程
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裂解与澄清
1 h超声或高压破碎细胞，离心取上清并过滤去除颗粒
💡 技巧 加蛋白酶抑制剂防降解
⚠️ 注意 保持低温操作
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2
亲和层析粗纯
2 h上样到装填亲和介质的柱或磁珠，洗涤去杂后用含咪唑/竞争剂洗脱
💡 技巧 优化咪唑浓度区分结合与洗脱
⚠️ 注意 上样量大不超柱容量
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3
精纯化(凝胶过滤/离子交换)
2–3 h用离子交换或凝胶过滤层析进一步去除杂质并换缓冲液
💡 技巧 凝胶过滤兼做缓冲液置换
⚠️ 注意 SEC需平衡柱及校准
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4
纯度与浓度鉴定
1 hSDS-PAGE检测纯度，BCA或A280测定浓度，必要时质谱/活性验证
💡 技巧 合并高纯度峰进行浓缩
⚠️ 注意 浓缩可能引起聚集沉淀
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 蛋白在纯化过程中降解
- ② 咪唑洗脱浓度不当致蛋白丢失或纯度低
- ③ 浓缩引起聚集与沉淀
- ④ 裂解不彻底降低回收率
- ⑤ 缓冲液不匹配可溶性差
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+如何判断纯度足够？
SDS-PAGE单一条带且凝胶呈单一峰，通常>95%可用于应用。
+纯化过程中蛋白聚集怎么办？
加还原剂、增溶剂、调pH/盐离子或添加稳定剂缓冲液。
+能一次亲和纯化到高纯度吗？
通常需联合精纯化步骤，亲和+SEC/IEX可获高纯度。