📋 实验流程
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蛋白提取与定量
2 h裂解细胞/组织提取总蛋白，定量并标准化
💡 技巧 去除高丰度互干扰蛋白
⚠️ 注意 防止降解和氧化修饰
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2
酶解为肽段
4–16 h还原烷基化后用胰蛋白酶将蛋白酶解为肽段
💡 技巧 完全消化提高覆盖度
⚠️ 注意 还原烷基化彻底防二硫键
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3
标记或多联质谱分析
2–4 天可作TMT标记后用液相-质谱分离鉴定；或作无标记DDA/DIA定量
💡 技巧 TMT可多重定量不同样本
⚠️ 注意 LC-MS条件稳定保重现性
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4
数据搜库与差异分析
1–2 天用搜库软件鉴定蛋白，统计差异表达并进行通路富集
💡 技巧 设FDR控假阳性
⚠️ 注意 统计严谨避免过度解读
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 消化不完全致覆盖度低
- ② 高丰度蛋白掩盖低丰度信号
- ③ 取样或处理差异致批次偏差
- ④ FDR失控致大量假阳性
- ⑤ 缺失值处理不当偏差
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+标记定量和无标记有何区别？
标记(TMT)可多重且精度高，无标记通量高成本低但偏差略大。
+如何提高鉴定深度？
深分级分离、高分辨质谱、富集低丰度或延长梯度。
+差异蛋白如何验证？
用WB、ELISA、SRM/PRM靶向质谱等方法独立验证候选蛋白。