📋 实验流程
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构建表达载体
1–2 天克隆目的基因到带标签(His/GST)的表达载体内含启动子和筛选标记
💡 技巧 标签便于后续纯化检测
⚠️ 注意 选择与宿主匹配的启动子
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2
转化与含菌培养
1 天转化感受态表达宿主菌，铺板挑单克隆，接种到含抗生素培养基
💡 技巧 挑单克隆保证均一性
⚠️ 注意 保持质粒的抗生素筛选
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3
诱导表达
4–6 h培养至OD600合适后加入IPTG，低温诱导数小时促进可溶表达
💡 技巧 低温慢诱导提高可溶性
⚠️ 注意 诱导温度和IPTG浓度需优化
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4
收获与检测
1 h离心收集菌体，裂解后取上清和沉淀，SDS-PAGE/WB检测表达量与可溶性
💡 技巧 同时看可溶与不溶分部
⚠️ 注意 未诱导对照对比表达
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 表达量低或不在预期位置
- ② 蛋白形成包涵体为不溶形态
- ③ 诱导条件不佳致降解或毒性
- ④ 未设诱导对照难判断表达
- ⑤ 载体或序列错误导致不表达
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+为什么蛋白主要在沉淀(包涵体)？
多见于表达快或复杂蛋白，降低温度、低速诱导或叠加促溶标签可改善。
+如何倍增表达量？
优化启动子、密码子、宿主菌株、诱导时机和培养条件。
+大肠杆菌能否表达所有蛋白？
不能，复杂修饰或糖基化蛋白需酵母/哺乳细胞等真核宿主。