📋 实验流程
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RNA提取与质检
2 h提取含小RNA的总RNA，检测浓度、完整性与纯度
💡 技巧 小RNA需专用提取方法保留
⚠️ 注意 RNase污染致小RNA降解
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2
反转录
2 h用颈环引物反转录miRNA，或加poly(A)后oligo-dT反转录lncRNA
💡 技巧 按靶类型选择加尾或颈环策略
⚠️ 注意 小RNA短需专用引物
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3
qPCR定量
2–3 h用特异引物和探针qPCR定量，设内参RNA标准化
💡 技巧 选合适内参(U6等)
⚠️ 注意 内参选择依小RNA类型
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4
数据分析与靶点验证
2 h用2^-ΔΔCt计算相对表达，并验证ncRNA的调控靶点
💡 技巧 多内参提高可信度
⚠️ 注意 靶点调控需功能实验验证
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 小RNA在普通提取中丢失
- ② RNase污染导致降解
- ③ qPCR内参选错致偏差
- ④ 引物特异性差致非特异扩增
- ⑤ 降解或表达平台期干扰定量
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+miRNA和基因表达定量有何不同？
miRNA短，需颈环引物或加尾策略反转录，且长度特异的探针。
+如何选内参？
miRNA常用U6或RNU6B，lncRNA常用GAPDH/ACTB，需按稳定性验证。
+如何验证ncRNA的靶基因？
用预测数据库结合报告基因、突变和overexpression/敲低等实验确认。