📋 实验流程
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蛋白消化
4–16 h还原烷基化后用胰蛋白酶将蛋白切为肽段
💡 技巧 胰蛋白酶特异切割K/R后
⚠️ 注意 还原烷基化充分防二硫键干扰
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2
脱盐与纯化
30 min用C18反相柱或StageTip去除盐和去污剂，浓缩肽段
💡 技巧 去盐可提升离子化效率
⚠️ 注意 洗脱完全避免肽段丢失
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3
液相分离与电离
2–4 h纳升液相梯度分离肽段，电喷雾电离后进入质谱仪
💡 技巧 长梯度提高分辨与鉴定数
⚠️ 注意 LC条件稳定保证重现性
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4
数据采集与分析
2–4 h采集MS/MS谱图，用搜库软件与蛋白数据库匹配并定量
💡 技巧 设置FDR控制假阳性
⚠️ 注意 质控校准保证质量准确
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 消化不完全导致肽段覆盖差
- ② 盐或去污剂污染抑制电离
- ③ 质谱校准漂移导致质量不准
- ④ 数据库不完整影响鉴定率
- ⑤ FDR设置不当产生假阳性
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+质谱能鉴定翻译后修饰吗？
可以，能定位磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰的位点。
+如何提高蛋白鉴定数？
优化LC梯度、富集低丰度肽段、增加分离维度或升高质谱分辨率。
+什么决定质谱灵敏度？
电离效率、进样量、质谱灵敏度及去盐净度共同决定。