📋 实验流程
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细胞裂解
30 min用温和含温和去污剂的裂解缓冲液裂解细胞，保留蛋白互作
💡 技巧 温和去污剂保留互作
⚠️ 注意 全程冰上加蛋白酶抑制剂
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2
抗体包被
2 h将特异性抗体与Protein A/G磁珠或琼脂糖结合，封闭非特异结合
💡 技巧 设IgG同型对照
⚠️ 注意 轻轻旋转防磁珠沉底
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3
免疫共沉淀
过夜裂解液与包被抗体的磁珠孵育过夜，使靶蛋白与其伙伴一起被沉淀
💡 技巧 长时间孵育增强捕获
⚠️ 注意 避免高盐强去污剂破坏互作
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4
洗涤洗脱与分析
2 h多次洗涤去除非特异蛋白，加洗脱缓冲液释放，SDS-PAGE/WB或质谱分析
💡 技巧 WB用不同抗体验证互作
⚠️ 注意 洗脱需彻底防残留
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 非特异结合导致背景高
- ② 抗体特异性差致假阳性互作
- ③ 强去污剂破坏弱蛋白互作
- ④ 洗涤不充分残留杂蛋白
- ⑤ 缺IgG对照难判特异性
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+IP和Co-IP有何区别？
IP富集单一靶蛋白，Co-IP同时捕获其互作伙伴以验证相互作用。
+如何减少非特异背景？
预清洗裂解液、加强洗涤、用IgG对照和推荐抗体浓度。
+选磁珠还是琼脂糖？
磁珠操作快、易分离且自动化好，琼脂糖柱适用传统流程。