📋 实验流程
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组织切片与脱蜡水化
1 h石蜡切片烤片后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化
💡 技巧 脱蜡彻底否则影响染色
⚠️ 注意 切片厚度与贴片平整
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2
抗原修复
30 min用热修复(枸橼酸或EDTA缓冲液)或酶修复暴露被掩蔽的抗原
💡 技巧 修复条件按抗体说明书优化
⚠️ 注意 温度时间过长破坏组织或抗原
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3
封闭与一抗
过夜用内源性过氧化物酶阻断和封闭液处理，孵育一抗
💡 技巧 设阴性对照和同型对照
⚠️ 注意 一抗浓度按推荐优化
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4
二抗与显色复染
2 h孵育HRP标记二抗，加DAB底物显色，苏木素复染后封片观察
💡 技巧 DAB显色需控制时间防过深
⚠️ 注意 显色到适度即水洗终止
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 脱蜡或修复不当致信号弱/背景高
- ② 内源过氧化物酶未阻断致背景深
- ③ 一抗浓度不当致非特异或漏染
- ④ DAB显色过深掩盖染色层次
- ⑤ 缺对照难判特异性
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+热修复和酶修复选哪个？
多数抗体优先热修复，抗体验证不足时按说明书选择。
+如何判断染色特异性？
设阴性、同型及抗原预吸附对照，特异性阳性应呈预期细胞定位。
+背景深怎么办？
加强阻断、降低一抗浓度、延长洗涤或减弱显色时间。