📋 实验流程
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细胞制片
1 h细胞种子玻片或玻璃底皿，处理后在合适汇合度准备固定
💡 技巧 玻片酸洗处理促贴壁
⚠️ 注意 密度适中防过度融合影响观察
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2
固定与通透
30 min4%多聚甲醛固定，Triton X-100通透以暴露抗原
💡 技巧 膜蛋白可免通透
⚠️ 注意 通透时间过久损伤膜结构
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3
封闭与一抗
2 h加封闭液减少非特异结合，孵育一抗过夜或1-2小时
💡 技巧 设阴性对照(仅二抗)
⚠️ 注意 一抗浓度按推荐优化
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4
二抗与成像
2 h孵育荧光二抗，洗涤后用封片剂(含DAPI)封片，荧光显微镜成像
💡 技巧 二抗避光孵育
⚠️ 注意 防褪色封片剂延长成像窗口
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 固定或通透不当导致假阴性或背景荧光
- ② 免通透不当导致膜蛋白定位错误
- ③ 非特异二抗结合导致背景高
- ④ 荧光淬灭导致成像后信号衰减
- ⑤ 缺阴性对照难判断特异性
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+如何判断染色特异性？
设仅二抗和封闭肽预吸附两类阴性对照，特异性结合应无信号。
+共定位如何分析？
双色图像计算Pearson系数等共定位指标，或三维重建确认。
+能否用石蜡切片？
可以，但需先脱蜡和抗原修复，再做IF。