📋 实验流程
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细胞制备
1 h制备外周血或脾脏等单细胞悬液，裂红或密度梯度分离免疫细胞
💡 技巧 低丰度亚群可先富集
⚠️ 注意 活力影响表型可靠性
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2
表面染色
1 h加入panel中荧光抗体组合，4℃避光孵育并洗涤
💡 技巧 设置FMO对照校准
⚠️ 注意 避光防荧光淬灭
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3
胞内标记(可选)
1 h如需分析细胞因子或转录因子，先破膜再染胞内抗体
💡 技巧 破膜后需保持渗透环境
⚠️ 注意 破膜后再染表面标记会失真
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4
上机与数据分析
2 h上机采集，用FMO/单染校正补偿，设门定量各免疫亚群比例
💡 技巧 一致门控保证可比
⚠️ 注意 高通道数注意光谱重叠
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 荧光补偿设置错误致亚群误判
- ② 破膜后表面标记失真
- ③ 细胞碎片或粘连干扰分析
- ④ panel设计不当光谱重叠严重
- ⑤ 缺FMO对照难界定阳性
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+什么是FMO对照？
荧光减一对照——除待测通道外保留全部染料，帮助设定阳性门。
+如何分析T/B/NK亚群？
用CD3/CD19/CD56等标志物panel gating各类淋巴细胞及其亚群。
+能否直接分选免疫细胞？
可以，用FACS-Sort按门物理分离亚群供培养或下游功能研究。