📋 实验流程
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板包被捕获抗体
过夜用细胞因子捕获抗体包被ELISpot板，4℃孵育过夜后封闭
💡 技巧 均匀包被保证斑点形成
⚠️ 注意 洗涤轻柔防抗体脱落
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2
细胞接种与刺激
24–48 h加入PBMC并加抗原/肽池刺激，培养箱内诱导细胞因子分泌
💡 技巧 设无抗原阴性对照
⚠️ 注意 细胞密度适中防斑点融合
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3
显色
2 h洗涤后加检测抗体和酶底物，显色形成斑点，终止后干燥
💡 技巧 控制显色时间防过深
⚠️ 注意 斑点过密无法计数
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4
斑点计数与分析
30 min用ELISpot读板仪计数各孔斑点数，计算抗原特异性细胞频率
💡 技巧 统一计数参数保可比
⚠️ 注意 排除非特异背景斑
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 包被不均导致斑点分布异常
- ② 细胞过多致斑点融合不可计数
- ③ 显色过深掩盖单个斑点
- ④ 缺阴性对照难定背景
- ⑤ 洗涤过猛致细胞或抗体丢失
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+ELISpot和ELISA有何区别？
ELISpot测单细胞分泌频率并定位，ELISA测总液量中分泌总量。
+如何判读阳性斑点？
对比阴性对照，斑点大小与密度明显高于背景且形态规则视为阳性。
+细胞密度如何设置？
依抗原特异性频率而异，常做细胞梯度稀释以落在可计数区。