📋 实验流程
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sgRNA设计与构建
1 天在线工具设计sgRNA，评估脱靶，克隆到Cas9表达载体
💡 技巧 优先选高特异性低脱靶的gRNA
⚠️ 注意 避免靶向非特异同源区
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2
递送转染
1 天转染细胞(脂质体/电转/核转)，或用RNP复合物提高效率
💡 技巧 RNP可降低脱靶
⚠️ 注意 转染后细胞应激需传代恢复
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3
筛选阳性克隆
1–2 周荧光筛选或有限稀释，挑单克隆扩增
💡 技巧 单克隆化避免混合群体
⚠️ 注意 亚克隆验证缺失纯合
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4
验证编辑效果
1–2 周通过测序验证基因型，WB检测蛋白表达验证敲除效果
💡 技巧 多种方法交叉验证
⚠️ 注意 敲除需同时证DNA和蛋白两个层面
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① sgRNA脱靶导致非特异编辑
- ② 转染或递送效率低导致阳性克隆少
- ③ 未单克隆化导致混合编辑群体
- ④ 未验证纯合敲除影响结果解读
- ⑤ 敲除验证不全蛋白表达未降
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+如何降低脱靶效应？
选高特异性gRNA、用高保真Cas9、或RNP递送并缩短作用时间。
+敲除不彻底怎么办？
多gRNA联合、单克隆纯化、或结合PAM/NHEJ机制优化。
+可否做点突变的敲入？
可以，用HDR供体模板和同源臂载体实现精确敲入。