📋 实验流程
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引物设计与PCR扩增
2 h设计带酶切位点或同源臂的引物，PCR扩增目的基因片段
💡 技巧 引物Tm相近且无二级结构
⚠️ 注意 用高保真聚合酶降突变
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2
载体与插入物处理
2 h限制酶双酶切载体和PCR产物，琼脂糖凝胶纯化回收目的片段
💡 技巧 胶回收去除残余酶和模板
⚠️ 注意 酶切彻底防自连
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3
连接反应
1 h按载体与插入物摩尔比混合，加T4连接酶连接，或用重组克隆试剂
💡 技巧 优化插入物与载体摩尔比
⚠️ 注意 设自连对照验证酶切彻底
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4
转化与筛选
1 天热激或电转转化感受态细胞，抗生素平板筛选，挑克隆PCR/测序验证
💡 技巧 设转化对照评价效率
⚠️ 注意 阳性克隆须测序确认序列
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 酶切不完全导致载体自连产生假阳性
- ② PCR引入突变影响蛋白表达
- ③ 插入方向错误导致不表达
- ④ 转化效率低导致挑不到阳性克隆
- ⑤ 未测序验证导致序列错误
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+如何确认插入方向正确？
用方向性PCR、限制酶切图谱或最终测序验证。
+重组克隆与酶切连接选哪个？
重组免酶切更高效，适合大量或组学；传统酶切灵活多样。
+如何减少PCR突变？
选高保真聚合酶、减少循环数、或直接合成gBlocks。