📋 实验流程
全流程一览，产品可直接加购1
细胞准备与处理
视实验而定贴壁细胞消化后重悬，或悬浮细胞计数，接种到6孔板并按实验方案处理
💡 技巧 处理浓度和时间梯度先行预实验确定
⚠️ 注意 避免过度消化损伤细胞膜
🧪 这一步需要的耗材（点「去选购」到产品页选规格/品牌）
2
收集与洗涤细胞
30 min收集上清与贴壁细胞，PBS洗涤两遍，重悬于结合缓冲液
💡 技巧 上清中的漂浮细胞也要收集
⚠️ 注意 PBS需预冷，减少操作损伤
🧪 这一步需要的耗材（点「去选购」到产品页选规格/品牌）
3
双染标记
30 min加入Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15分钟
💡 技巧 设单染和未染对照用于补偿
⚠️ 注意 孵育后尽快上机，PI随时间增加背景
🧪 这一步需要的耗材（点「去选购」到产品页选规格/品牌）
4
流式检测与分析
1 h上流式细胞仪检测，用软件分析四象限：活/早期凋亡/晚期凋亡/坏死
💡 技巧 每管至少收集1万事件
⚠️ 注意 保持一致的门控策略保证可比性
🧪 这一步需要的耗材（点「去选购」到产品页选规格/品牌）
⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 胰酶消化过度导致假阳性凋亡
- ② 未收集上清漂浮细胞，丢失晚期凋亡群体
- ③ PI背景随孵育时间增长导致假阳性
- ④ 缺单染/未染对照导致补偿错误
- ⑤ 门控策略不一致导致批次间不可比
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+活细胞/早期/晚期凋亡/坏死如何区分？
Annexin V-PI双阴性为活细胞，AV单阳为早期凋亡，双阳为晚期凋亡，PI单阳为坏死。
+为什么会出现大量PI单阳？
常见于机械损伤、消化过度或收集过晚导致的继发性坏死，需优化操作减少损伤。
+能否用固定细胞检测凋亡？
固定会破坏膜结构影响Annexin V结合，活细胞上机更可靠。