📋 实验流程
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质粒三质粒共转染
1 天将目的基因质粒、rep/cap及辅助质粒共转染入高密度293T细胞
💡 技巧 三质粒比例需优化
⚠️ 注意 转染效率决定滴度
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2
培养与病毒收集
3–5 天培养数天后收集含病毒的上清和/或裂解细胞释放病毒
💡 技巧 AAV可同时收细胞内外病毒
⚠️ 注意 收集时间点影响滴度
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3
纯化浓缩
1 天用超速离心、亲和柱或PEG沉淀纯化并浓缩病毒颗粒
💡 技巧 纯化提升纯度和活性
⚠️ 注意 避免剪切力致病毒失活
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4
滴度测定与质检
1 天用qPCR测基因组滴度，或GFP/感染法测感染滴度并做内毒素等质控
💡 技巧 基因组与感染滴度都要测
⚠️ 注意 避免交叉污染和假滴度
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① 三质粒比例不当致滴度低
- ② 293T状态差致包装失败
- ③ 剪切力或冻融致病毒失活
- ④ 纯化不彻底致杂蛋白/杂质污染
- ⑤ 滴度测定误差致用量不准
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+AAV和慢病毒有何区别？
AAV不整合、免疫原性低适体内；慢病毒整合基因组适合稳定表达。
+如何提高包装滴度？
优化质粒比例、转染效率、收获时机和纯化浓缩步骤。
+为什么测两种滴度？
基因组滴度反映颗粒总数，感染滴度反映有效入胞量，需对比判断质量。