📋 实验流程
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菌落DNA提取
30 min挑单菌落进行碱裂解或试剂盒提取基因组DNA
💡 技巧 热裂解简便适合多数革兰阴性
⚠️ 注意 充分裂解得完整DNA
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2
16S PCR扩增
2 h用通用引物(如27F/1492R)PCR扩增16S基因全长或片段
💡 技巧 通用引物覆盖广谱菌种
⚠️ 注意 设阴性对照防污染
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3
纯化与测序
数小时-1天凝胶电泳验证、纯化PCR产物后用桑格或高通量测序获得序列
💡 技巧 双向测序拼接更准
⚠️ 注意 产物净度影响测序质量
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4
数据库比对鉴定
30 min用BLAST或EzBioCloud等工具对序列进行同源性比对确定种属
💡 技巧 相似度≥99%可鉴定到种
⚠️ 注意 低相似度需结合表型验证
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⚠️ 新手常犯的 5 个错误（避坑指南）
- ① DNA纯度差致PCR失败
- ② 引物污染致假序列
- ③ 序列质量差难比对
- ④ 相似度过低无法定种
- ⑤ 数据库不完整引误判
❓ 常见问题（做坏了怎么办）
+多高的相似度可定种？
通常16S相似度≥98.7%可判为同种，更高更可靠。
+16S能区分所有近缘菌吗？
部分近缘菌种间16S差异小需补充其他方法如全基因组或生化。
+扩增全长还是片段好？
全长信息更全但需长读长，200-500bp V区高通量测序适合菌群分析。